Присоединяйтесь!
Зарегистрированных пользователей портала: 506 381. Присоединяйтесь к нам, зарегистрироваться очень просто →
Законодательство
Законодательство

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Дата документа02.09.1985
Статус документаОтменен/утратил силу
МеткиПриказ · Инструкция
x
Документ отменен / утратил силу
Документ отменен или утратил силу. Подробная информация приводится в примечаниях к документу.

    

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

 

ПРИКАЗ
от 2 сентября 1985 г. N 1161

 

О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

 
    В целях дальнейшего совершенствования диагностики сифилиса:
    I. Утверждаю: Инструкцию по постановке серологических реакций на сифилис.
    II. Приказываю:
    1. Министрам здравоохранения союзных республик ввести в действие с 1 января 1986 года прилагаемую Инструкцию. Размножить настоящую Инструкцию в необходимых количествах и довести ее до исполнителей.
    2. Считать утратившей силу Инструкцию но постановке серологических реакций на сифилис, утвержденную приказом Министра здравоохранения СССР от 27 февраля 1963 года N 86.
    3. Контроль за выполнением приказа возложить на заместителя Министра здравоохранения СССР т. Сафонова А.Г.
 

Министр
С.П.БУРЕНКОВ

 
 
    

Приложение
к Приказу Минздрава СССР
от 2 сентября 1985 г. N 1161

 

ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС

 
    Настоящая инструкция от ранее утвержденной Министерством здравоохранения СССР в 1963 году отличается тем, что в составе комплекса серологических реакций на сифилис (КСР), предназначенного для диагностики данного заболевания, предусмотрено применение реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами и микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР). Более высокая чувствительность и информативность этого комплекса реакций обеспечивается выявлением не только реагинов, но и противотрепонемных антител. РСК с неспецифическим (вассермановским) антигеном и осадочные реакции цитохолевая и Кана из диагностического комплекса исключены как менее чувствительные и не дающие дополнительной информации.
    Данная инструкция предусматривает применение следующих реакций для серо- и ликвордиагностики сифилиса, а также для отборочных исследований на сифилис:
    1. МР с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови и инактивированной сывороткой крови;
    2. РСК с трепонемным и кардиолипидовым антигенами; качественная и количественная методики постановки, термостатная и на холоде;
    3. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ); пробирочная и меланжерная методики постановки;
    4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ с абсорбцией (РИФ-абс) с сывороткой крови и капиллярной кровью, РИФ-200, РИФ с цельной спинномозговой жидкостью (РИФ-ц); качественные и количественные методики постановки.
    В связи с различной чувствительностью, специфичностью и сложностью постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.
    Профилактическое обследование населения на сифилис должно проводиться с помощью экспресс-метода или КСР. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей, однако необходимо учитывать, что широкое внедрение в практику экспресс-метода рассчитано, в основном, не на замену им КСР, а на резкое увеличение контингентов, профилактически обследуемых на сифилис. РСК с трепонемным антигеном является более чувствительной реакцией, чем МР, особенно при поздних формах сифилиса, когда в крови больных могут отсутствовать или быть в низкой концентрации реагины.
    С помощью микрореакции обследуются лица, подлежащие периодическим медицинским осмотрам на венболезни, а также лица, помещенные в медицинские вытрезвители, спецприемники, приемники-распределители, изоляторы для временного содержания под стражей, условно-досрочно освобожденные и направляемые на стройки народного хозяйства, а также условно осужденные, состоящие на учете в спецкомендатурах.
    МР при изолированном применении является не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании ее позитивности диагноз сифилиса не устанавливается, а обследуемые направляются к дерматовенерологу, который должен подвергнуть их клиническому обследованию и организовать исследование их крови в КСР, РИТ, РИФ.
    КСР применяется для диагностики всех форм сифилиса, контроля эффективности лечения, обследования лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, лиц с клиническим и анамнестическим подозрением на сифилис, а также при профилактическом обследовании на сифилис больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, включая лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности. РСК на холоде применяется в случае получения отрицательного результата при использовании термостатного метода для диагностики всех форм сифилиса.
    Из специфических реакций на сифилис наиболее широкое применение в Советском Союзе нашли РИТ и РИФ. Более специфичным тестом является РИТ; РИФ-абс и РИФ-200 по специфичности приближаются к ней. РИТ и РИФ необходимы для диагностики скрытых и поздних форм сифилиса, распознавания ложно-положительных результатов КСР и МР, особенно у беременных и соматических больных, при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилитическую инфекцию, для установления ретроспективного диагноза заболевания, а также при установлении излеченности сифилиса. Но главным показанием к постановке РИТ является наличие положительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис у лиц без клинических и анамнестических признаков сифилиса, в то время как при обследовании половых контактов больных сифилисом и диагностике первичного серонегативного сифилиса лучшим диагностическим тестом является РИФ-абс, т.к. при ранних формах заболевания реагины, преципитины, комплементсвязывающие антитела и иммобилизины могут еще не выявляться. Отсутствие тех или иных антител или их малая концентрация в крови могут наблюдаться и при других формах сифилиса, главным образом, в поздней стадии заболевания, в связи с чем параллельная постановка нескольких специфических серологических тестов повышает возможность выявления больных сифилисом. Диагноз скрытого сифилиса требует обязательного подтверждения положительными результатами специфических серологических реакций.
    Использование различных модификаций постановки серологических реакций на сифилис определяется целью исследования. Постановка РСК на холоде повышает чувствительность этой реакции. На результаты РИФ-абс целесообразно ориентироваться при диагностике тех форм заболевания, которым свойственна малая концентрация сифилитических антител в крови, т.к. при ее постановке исследуемая сыворотка крови разводится лишь в 5 раз. При серологическом обследовании новорожденных детей, а также при невозможности получения крови из вены у взрослых и детей следует использовать методику постановки РИФ-абс с капиллярной кровью. При серологическом обследовании больных сифилисом в процессе и после окончания лечения применяются РСК и МР в количественном варианте, комплекс серологических реакций с реакцией Кана, РИТ, РИФ. С целью ликвордиагностики сифилиса надо применять наиболее чувствительную РИФ-ц, при невозможности ее постановки - РСК на холоде.
    При постановке серологических реакций на сифилис должен соблюдаться ряд условий. МР с плазмой может осуществляться только в день взятия крови из пальца, при транспортировке ее необходимо предохранять от замерзания и высушивания. При невозможности выполнения этих требований МР должна ставиться с инактивированной сывороткой крови. В КСР, РИТ и РИФ можно исследовать с диагностической целью высушенные на вощаной бумаге или целлофане сыворотки крови в тех случаях, когда нет возможности провести исследование нативной сыворотки крови, однако кровь доноров и (беременных должна исследоваться и нативном состоянии.
    При изолированном исследовании в МР сыворотка крови и плазма должны быть нативными.
    Постановка МР, как составной части КСР на сифилис, должна осуществляться в серологических лабораториях. При изолированном использовании МР в качестве отборочного теста ее постановку можно проводить как в серологических лабораториях, так и в клинико-диагностических с целью широкого охвата населения профилактическим обследованием на сифилис.
    Для постановки МР должны быть выделены врачи, лаборанты, медицинские сестры, прошедшие специальную подготовку по этому вопросу. Средний медицинский персонал производит взятие крови из пальца и постановку МР, в то время как учет ее результатов осуществляют врачи-лаборанты или врачи другой специальности, получившие соответствующую подготовку. Врачи несут ответственность за постановку экспресс-метода.
    Постановка КСР и специфических реакций на сифилис производится в серологических лабораториях кожно-венерологических учреждений, а в сельской местности постановка КСР - в лабораториях сельских районных больниц.
    Подготовка врачей-серологов и повышение их квалификации должны осуществляться в кожно-венерологических учреждениях (научно-исследовательских кожно-венерологических институтах, республиканских, областных, краевых и тех городских кожно-венерологических диспансеров, на которые возложены функции организационно-методических центров), а также на кафедрах микробиологии и лабораторной клинической диагностики институтов и факультетов усовершенствования врачей.
    Обучение врачей и среднего медицинского персонала постановке МР должно осуществляться в серологических лабораториях научно-исследовательских кожно-венерологических институтов, краевых, областных и городских кожно-венерологических диспансеров.
    Серологические лаборатории научно-исследовательских кожно-венерологических институтов, республиканских, краевых, областных и городских кожно-венерологических диспансеров должны осуществлять контроль качества всех применяемых серологических реакций в лабораториях подведомственных территорий. Большое внимание необходимо уделять контролю качества постановки МР, т.к. она осуществляется не только в серологических лабораториях, имеющих квалифицированные кадры серологов, но и в клинико-диагностических лабораториях.
 

Отборочные микрореакции преципитации

 

Принцип

 
    При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.
 

Оборудование, необходимое для взятия крови из пальца и вены и постановки реакции

 
    Капиллярные пипетки аппарата Панченкова.
    Градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл.
    Пастеровские пипетки.
    Пробирки длиной 8-10 см и 14-15 см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные.
    Пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см.
    Иглы для взятия крови из пальца и из вены.
    Резиновая груша.
    Центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин.
    Аппарат для встряхивания.
    Стерилизатор для кипячения игл, шприцев, инструментов.
 

Ингредиенты

 
    Антиген кардиолипиновый для микрореакции.
    Холин-хлорид (включается в упаковку с антигеном).
    Натрий хлорид х.ч.
    Натрий лимоннокислый (цитрат натрия) трехзамещенный (Na3C6H5O7 x 5H2O).
    Мертиолат C9H9O2S NaHg.
 

Растворы

 
    Изотонический раствор хлорида натрия 0,9%.
    10% раствор холин-хлорида. Готовится следующим образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата и 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10% раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Раствор стойкий, при отсутствии бактериального загрязнения хранится 10-12 месяцев при 4°.
    5% раствор трехзамещенного цитрата натрия готовится на дистиллированной воде и фильтруется. Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять свежим. Хранится в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней.
    Контрольные лиофилизированные сыворотки крови, необходимые для установления пригодности эмульсии антигена, выпускает Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов. Отрицательную и положительную сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые, с целью экономии, разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции свежую или размороженную в одной пробирке сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.
    Титрование сыворотки крови проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунку по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая и выпуская его в лупку 5-6 раз. Затем набирают часть содержимого второй лупки в пастеровскую пипетку и три капли переносят в третью лунку, а оставшуюся в пипетке сыворотку крови возвращают во вторую лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и три капли переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки три капли удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсин кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 минут, добавляют по три капли изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после этого регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/2+), используют в качестве слабоположительнго контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1 : 8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.
    При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.
    При снижении реактивности хранящейся контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+- в разведении не ниже, чем 1 : 2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше, чем 1 : 4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.
    При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивания, т.к. в этом случае реактивность их снижается.
    О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.
    Серологические лаборатории кожно-венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс-метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.
    Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации, выпускаемого Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов Министерства здравоохранения СССР. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.
    Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина, их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37° или 56° соответственно.
    Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3, 5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин-хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин-хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин-хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают, опрокидывая пробирку, до полного ресусиендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнения при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.
    Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4° не более недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс-методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагинов, отличающихся на ё1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови, а также отсутствие преципитата в отрицательной сыворотке крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а) слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови, б) более низкий (на 2 - 3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией, в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.